多管齊下,嚴防非洲豬瘟變異株
發布時間 : 2021-06-28 16:01:50一、非洲豬瘟變異株的定義
非洲豬瘟變異株包括基因缺失株、自然變異株、自然弱毒株等,與2018年傳入的非洲豬瘟毒株相比,該類毒株的基因組序列、致病力等發生明顯變化。生豬感染該類毒株后,潛伏期延長,臨床表現輕微,后期可出現關節腫脹、皮膚出血型壞死灶,感染母豬產仔性能下降、死淘率增高,出現流產死胎/木乃伊胎等。與傳統的流行毒株相比,生豬感染該類毒株后排毒滴度低、間隙性排毒,難以早期發現。
二、監測方法
(一)加強臨床巡視
時刻關注豬場各個環節豬只異常情況,想方設法提升飼養人員責任心,一旦發現豬只出現嗜睡、輕觸不起、采食量減少,發熱、皮膚發紅、關節腫脹/壞死、咳喘、腹式呼吸,育肥豬死淘率增高,母豬流產或出現死胎/木乃伊胎等可疑臨床表現時,應第一時間采樣檢測。
(二)改進主動監測
每周對豬群進行病原和抗體檢測。在豬群進行疫苗接種、轉群、去勢,或母豬分娩后,應進行采樣檢測。豬場出現風險暴露或周邊豬場出現感染時,按需進行采樣檢測。
(三)抽樣策略
對可疑豬的同舍和關聯舍豬群,采集深部咽拭子和抗凝血,進行病原檢測,必要時采集血清進行抗體檢測。對可疑豬及臨近豬接觸的地面、欄桿,以及舍內人員接觸的物品等,采集環境樣品進行病原檢測。病原檢測如果混檢,建議混樣數量不超過5個;抗體檢測不得混樣。
(四)樣品選擇
1. 對可疑豬,按檢出概率高低排序,依次采集深部咽拭子、前腔靜脈抗凝血(EDTA)或尾根血、口鼻拭子。
2. 對分娩母豬,應采集臍帶血、胎衣;對死胎和流產胎兒,應采集淋巴結、脾臟等組織樣品。
3. 對病死豬,優選采集部位為淋巴結、脾臟、骨髓和肺臟。
4. 血清樣本,按常規方法制備。
三、檢測方法及配套
(一)采樣
豬場用戶在進行環境樣監測或者群體普查時,可在采樣時使用快靈的軟拭子和多腔體病毒采樣管進行高效采樣及混樣。
軟拭子頭部具有彈性,彈性絨毛拭子頭較容易彎曲來適應豬場不同的異性部位,增大采樣接觸面積,其面積比普通紡錘形拭子多2-3倍,能更多采集目標樣品。
多腔體采樣管不同于市面上傳統的采樣管,其內部結構分別為洗滌腔及擠存腔,洗滌腔體內設有多個豎向刮擦片,對進入腔體中旋轉的拭子進行接觸刮擦,幫助絨毛表面的樣品洗脫釋放。多個擠存錢腔可以最多十根軟拭子,釋放了樣本后將拭子插入洗滌腔上部的擠壓腔,可將彈性植絨拭子吸附的洗脫液擠壓出來并從縫隙部位回流到洗滌腔。相比傳統采樣管,僅用少于1/5容積的液體就能充分對拭子樣品進行洗滌,能直接提高采樣溶液病原濃度達5-6倍。
(二)病原檢測方法
原則上參照“農辦牧〔2020〕39號”附件《非洲豬瘟病毒流行株與基因缺失株鑒別檢測規范》。
對采集的樣本進行核酸提取,可選用快靈的手動柱法提取試劑盒,樣本量太大可使用快靈磁珠提取試劑盒。
擴增時建議選用快靈ASFV流行株/基因缺失變異株鑒別試劑盒,即P72/MGF/CD2V鑒別試劑盒(下稱鑒別試劑盒),為了適配不同客戶的不同儀器,快靈鑒別試劑盒在標準試劑盒的基礎上進行部分優化,僅涉及檢測項目,試劑盒靈敏度、特異性等基本功能保持一致,方便客戶根據不同的需求進行選擇。不同試劑盒性能見表1:
表1:不同鑒別試劑盒性能說明
性能 |
非洲豬瘟病毒P72/CD2V熒光PCR鑒別試劑盒 |
非洲豬瘟病毒P72/MGF熒光PCR鑒別試劑盒 |
非洲豬瘟病毒P72/CD2V/MGF熒光PCR鑒別試劑盒(三重雙通道) |
非洲豬瘟病毒P72/CD2V/MGF熒光PCR鑒別試劑盒(標準版) |
鑒別基因型 |
P72/CD2V |
P72/MGF |
P72/CD2V/MGF |
P72/CD2V/MGF |
所需通道 |
雙通道 |
雙通道 |
雙通道 具備熔解曲線功能 |
三通道 |
反應方式 |
PCR 擴增 |
PCR 擴增 |
PCR 擴增+熔解曲線反應 |
PCR 擴增 |
反應時長 |
55min |
55min |
70min (擴增+熔解) |
55min |
反應體系 |
25 μL |
25 μL |
25 μL |
25 μL |
判讀方式 |
Ct 值判讀 |
Ct 值判讀 |
Ct 值與Tm值綜合判讀 |
Ct 值判讀 |
規格 |
50T/ 盒 |
50T/ 盒 |
50T/ 盒 |
50T/ 盒 |
靈敏度 |
400copies/mL |
400copies/mL |
400copies/mL |
400copies/mL |
特異性 |
≥99.9% |
≥99.9% |
≥99.9% |
≥99.9% |
敏感性 |
≥99.9% |
≥99.9% |
≥99.9% |
≥99.9% |
穩定性 |
CV <3% |
CV <3% |
CV <3% |
CV <3% |
UDG 酶 |
有 |
有 |
有 |
有 |
(三)抗體檢測方法 采用間接ELISA、阻斷ELISA等方法檢測抗體水平,詳見《非洲豬瘟診斷技術》(GB/T 18648)
抗體檢測的意義 對于急性疾病的爆發,病毒檢測(PCR)最有用,血清學診斷價值較低,因為感染的豬大多數在抗體產生之前死亡;非洲豬瘟變異株(包括基因缺失株、自然變異株、自然弱毒株等)的出現,生豬感染該類毒株后,潛伏期延長,臨床表現輕微,感染該類毒株后排毒滴度低、間隙性排毒,難以早期發現,因此抗體檢測的作用凸顯。如果沒有接種過疫苗,抗體的存在表明感染過非洲豬瘟病毒。上海快靈非洲豬瘟病毒ELISA抗體檢測試劑盒(間接法)系用大腸桿菌表達的非洲豬瘟病毒P30蛋白包被酶標板,P30蛋白是病毒的主要結構蛋白,在感染的早期表達和分泌,可用于感染后免疫反應的的早期檢測。
ELISA 抗體檢測原理 ELISA 試劑盒是根據固相酶聯免疫吸附試驗設計而成的。在本檢測過程中,樣本暴露于包被在微量板孔內的非感染性非洲豬瘟抗原。非洲豬瘟抗體(如果檢測樣本中存在)則將與酶標板上抗原結合,經洗滌除去未結合的其他成分后;再加入酶標記物,與酶標板上抗原抗體復合物發生特異性結合;再經洗滌除去未結合的酶標記物,在孔中加TMB底物液,與酶反應形成藍色產物,顯色深淺與樣品中的特異性抗體含量成正相關;加入終止液終止反應后,產物變為黃色;用酶標儀在450nm波長測定各反應孔中的吸光值,即可知樣品是否含有非洲豬瘟抗體。
上海快靈非洲豬瘟病毒ELISA抗體檢測試劑盒(間接法)使用便捷、快速、敏感性高、特異性強,是理想的非洲豬瘟病毒抗體測工具。