高敏PCR試劑盒(熔解確認版) ——快靈高敏試劑盒“PLUS”!
發布時間 : 2021-06-28 16:07:19自2020年10月上海快靈發布“非洲豬瘟高敏PCR試劑盒”(下稱高敏試劑盒)以來,其出色的靈敏度、敏感性、特異性及穩定性迅速被廣大豬場實驗室認可。隨著熒光PCR相關技術的普及以及用戶群體的增大,部分之前未被重視的問題也逐漸顯露出來。本篇我們探討下各廠家都諱莫如深的一個點——“假陽”問題,以及相應的解決方案。
“假陽”問題,事實上在熒光PCR領域并不少見,而造成假陽產生的原因也是紛繁復雜:如操作不當污染、環境氣溶膠污染或者試劑生產過程污染等。本文所要探討的“假陽”,主要指因試劑特異性導致的假陽,換句話說,即文中所提的“假陽”,與操作者、儀器、環境均無關,只與試劑盒內的試劑有關。那么試劑盒中到底什么與“假陽”相關呢?縱觀商業化的非瘟病毒PCR檢測試劑盒,其中都會提及一個重要參數——特異性。
何為特異性呢?在PCR擴增過程中,如果我們要擴增的非洲豬瘟DNA片段在整條DNA鏈上不止出現了一次,或者樣品中混有的其他物種、細胞或病毒的DNA中含有類似的DNA片段,則可能會將其他片段擴增出來,那最后儀器顯示出來的陽性結果就不一定是非瘟病毒DNA造成的,于是陽性結果也就變成了假陽。因此,通俗來說,特異性反應的是試劑盒能擴增出特定DNA片段的性能,特異性越低,則試劑盒擴增其他片段的概率就越大,即“假陽”幾率更大。
市售的眾多非瘟病毒PCR檢測試劑盒中,絕大多數廠商在宣傳其試劑盒特異性時均會標注>99%,最低也不會低于98%,快靈的高敏試劑盒也是如此,特異性可達到99.9%,屬實是已經做到了極限,即使PCR技術發展至今,因為模板DNA的不確定,依然無法保證100%的特異性。也正因此,特異性,也就是假陽的問題是被大家忽視了。
在服務客戶的過程中,我們發現很多客戶在進行非瘟病毒檢測遇到極弱樣本或疑似樣本時,對于陽性場,往往遵循的是 “ 寧殺錯,不放過 ” ,而對于陰性場,往往帶來心理的恐慌,需要確認到底是不是陽性。的確,隨著非瘟一波波的襲來,各檢測單位的工作量都史無前例的倍增,再重新來一遍的全面復核,顯然是對人力和成本的巨大考驗。面對這樣的大環境,快靈人陷入了沉思。
“我們為什么要寧殺錯?”
“當真沒有辦法消除假陽么?”
帶著這樣的問題,我們開始了新的一輪又一輪的嘗試:提升試劑盒的靈敏度、將特異性由99%提升至99.9%……或許,我們可以把眼界放寬,不局限于單純的擴增?
于是,高敏試劑盒上市半年后,我們在高敏試劑盒基礎之上研發出其“升級版”——快靈高敏試劑盒(熔解確認版)。
快靈高敏試劑盒(熔解確認版),其性能參數與高敏試劑盒一致,我們同樣保證其靈敏度、敏感性、穩定性、特異性處在行業頂尖水平,確保客戶可以第一時間檢測出陽性樣本。包括其操作、擴增階段也與高敏試劑盒別無二致,至此,我們可以把快靈高敏試劑盒(熔解確認版)等同于高敏試劑盒。詳見表1:
表1:高敏試劑盒與假陽確認試劑盒基本性能參數對比
性能 |
高敏試劑盒 |
高敏試劑盒(假陽確認版) |
靈敏度 |
400copies/mL |
400copies/mL |
敏感性 |
≥99.9% |
≥99.9% |
特異性 |
≥99.9% |
≥99.9% |
穩定性 |
CV <3% |
CV <3% |
規格 |
50T/ 盒 |
50T/ 盒 |
反應體系 |
25 μL |
25 μL |
反應時長 |
55min |
55min (單擴增) 70min (擴增+熔解) |
UDG 酶 |
有 |
有 |
內標 |
有 |
有 |
但,重點來了!快靈是怎么做到的?快靈高敏試劑盒(熔解確認版)突破性地使用了一個新的反應程序——熔解曲線。熔解曲線能鑒別不同的DNA片段,依靠的不是Ct.值,而是其特有的熔解峰,即Tm值,即使一個DNA片段中僅相差一個堿基,都能導致Tm值變動。依靠Tm值的判定就可以確認之前擴增陽性的非瘟樣本是否為真的非瘟陽性,以此達到鑒別假陽,消除客戶疑慮的目的。
圖1:擴增曲線Ct.值判讀陰陽 圖2:熔解曲線檢測疑似/弱陽樣本,排除假陽
非瘟新形勢下,除了要求試劑盒更早的檢測出陽性,更需要真正“精準”檢測。快靈高敏試劑盒(熔解確認版)除了超高的靈敏度、特異性,更是“自帶”熔解曲線,讓假陽無處可藏,讓弱陽“站得住腳”,真正做到打消客戶疑慮,真正做到“不殺錯、不放過”。